デジタルPCR (Droplet Digital PCR) 解析

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■デジタルPCRとは

デジタルPCRは従来のリアルタイムPCRに比べてはるかに高精度、高感度に定量を行う新しい技術です。定性のみの通常PCR、検量線による相対定量のリアルタイムPCRに対して、絶対定量を行うデジタルPCRは第3世代のPCRと言われています。

デジタルPCRはリアルタイムPCRと全くコンセプトが異なり、限界希釈（各微小区画にターゲットDNAが1または0となるような希釈）したサンプルDNAを微小区画内に分散させてPCR増幅を行います。これによってターゲット遺伝子を含む微小区画では増幅シグナルがポジティブとなり、ターゲット遺伝子を含まないもしくはサンプルDNA自体を含まない微小区画では増幅シグナルがネガティブとなります。ポジティブの微小区画の数を直接カウントすることでサンプル中のターゲット遺伝子濃度を絶対的に測定します。

限界希釈したサンプルDNAであっても微小区画あたりの断片数が1以上になる場合があります。これを補正するため、ポジティブの数と微小区画の数をポアソン分布にあてはめて最終濃度を算出します。ポアソン分布での補正はソフトウェアにより自動的に算出されます。

ジェネティックラボではドロップレットを自動調製するDroplet Generatorを導入しているため、多検体を再現性良く測定することが可能です。

■Droplet Generatorの仕様

機器名	QX200 Droplet Digital PCRシステム
販売会社	バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社
サンプル容量(μL)	20
QX200 Droplet Generator 1ランあたりのサンプル処理数	1 ～ 96 サンプル
サンプル20μLあたりのドロップレット数	最大20,000
励起光源	2LED
検出器	MPPC (Multipixel Photon Counters)
検出チャネル	FAM (EvaGreen)、HEX (VIC)
ダイナミックレンジ	5オーダー
精度	±10%
読み取り区画数	10,000以上/サンプル
QX200 Droplet Generator サイズ (W x D x H)	28 x 36 x 13 cm (11 x 14 x 5")
QX200 Droplet Reader サイズ (W x D x H)	66 x 52 x 29 cm (26 x 20 x 11")
QX200 droplet reader capacity	1-96 samples

■ddPCRの特長

絶対定量	1mLあたりのコピー数検量線不要エンドポイント測定なので、増幅効率に影響されにくい
高精度	1.1倍希釈系列を判別可能 qPCRでは困難な低濃度域での精度が高い
高感度	バックグラウンドの影響を減少させて、微量なターゲットを増幅 0.001%オーダーで検出
高処理性	1回のランで96サンプルの測定が可能低ランニングコスト

■デジタルPCRのアプリケーション

CNV（Copy Number Variation）
Rare mutation / Rare sequence 検出
mRNA、 miRNA 定量（高精度定量、低コピー数定量）
Single cell など、微量サンプルでの定量

■ワークフロー

1. ドロップレットの作成

専用カートリッジに調製したサンプルおよび専用オイルを分注します。
カートリッジをセットした後、サンプルを微小区画に分割します。
ターゲットDNAとバックグラウンドDNAがランダムに分散します。

2. PCR

専用カートリッジの各ウェルで作成したドロップレットを、96ウェルのPCRプレートの各ウェルに移し、シーリングを行います。
その後、それぞれの微小区画で個別にPCR反応を行います。

3. ドロップレット蛍光測定およびデータ解析

PCR終了後、96ウェルPCRプレートをQX200 Droplet Readerにセットします。
各ウェル内のドロップレットの蛍光を測定し、ポジティブな微小区画の数およびネガティブな微小区画の数を直接カウントします。
QuantaSoftソフトウェアを使用し、ポジティブな微小区画の割合からターゲットの濃度(コピー/μL)を算出します。

【バイオ・ラッド社の製品紹介ページ】http://www.bio-rad.com/ja-jp/category/digital-pcr

※セルフリーDNAの解析は、解析用に専用採血管を準備し、全血より血漿の回収から受託いたします。凍結した血清、血漿からの受託も可能です。

■使用プローブ例

リキッドバイオプシーに対応して開発されたプローブが使用可能です。
Singleplex用のプローブを用いたtypingだけでなく、Multiplex用のプローブを用いたtyping、ホットスポットに対するプローブを用いたScreeningが可能です。
対象がん種に対して薬剤感受性または耐性変異の検出が可能です。変異のモニタリングに最適です。

【変異解析用プローブ】

※「検出screening」については、対象変異のいずれかが存在した場合に検出できるという製品となっており、対象変異を個別に見分けることはできないものになります。

対象組織	遺伝子	対象変異	検出
Lung	ALK	p. E17K	single
		p. T1151_L1152insT	single
		p. L1152R	single
		p. C1156Y	single
		p. I1171T	single
		p. F1174L	single
		p. V1180L	single
		p. L1196M	single
		p. G1202R	single
		p. S1206Y	single
		p. G1269A	single
		p. L1198F	single
		p. T1151_L1152insT, p. C1156Y, p. L1196M, p. G1269A	multi
		p. L1152R, p. F1174L, p. V1180L	multi
		p. I1171T, p. G1202R, p. S1206Y	multi
	EGFR	p. L858R	single
		p. T790M	single
		p. C797S (c.2389T>A, c.2390G>C)	multi
		p. G719C/A/S	multi
		Exon19 Deletion	screening
	PIK3CA	p. E542V/K, p. E545V/G/A/Q/K, p. Q546L/R/P/E/K	screening
	PIK3CA	p. H1047L/R/Y, p. G1049R/S	screening
	ROS1	p. G2032R	single
Brest	ESR1	p. Y537N	single
		p. Y537S	single
		p. D538G	single
		p. E380Q	single
		p. Y537N/S, p. D538G	multi
		p. V534E, p. P535H, p. L536R/Q/P/H, p. Y537N/C/S, p. D538G	screening
		ESR1/YAP1 fusion	expression
	PIK3CA	p. E542V/K, p. E545V/G/A/Q/K, p. Q546L/R/P/E/K	screening
	PIK3CA	p. H1047L/R/Y, p. G1049R/S	screening
Melanoma	BRAF	p D549G/N, p. K601E, p. V600E/K/R/G/M/D	screening
	NRAS	p. Q61R/K/L?H/P/E, p. E62K	screening
	MEK1	p. C121S, p. P142S/L, p. G128V/D, p. F129L	screening
Other	AR	AR v7	expression
	EGFR	p. S492R (c. 1474A>C)	single
	EGFR	p. S492R (c. 1476C>A)	single
	SMO	p. D473H	single

【CNV解析用プローブ】

対象遺伝子			reference
AKT1	CTNNB1	IGF2R	AP3B1
AKT2	EGFR	KIT	APOB
ALK	ESR1	KRAS	AQP5
AR	FGFR1	MEK	PMP22
BRAF	FGFR2	NRAS	RPP30
CCND1	FGFR3	PDGFRA	TOP3A
CDK4	HER2	PIK3CA	-
CDK6	IGF1R	VEGFR
cMET	-

※表にないターゲットについても対応可能な場合がございますので、ご検討内容をお問い合わせください。

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